質量分析のソフトイオン化温故知新:Frit-FABのあれこれ-2

5/1719に行われた第65回質量分析総合討論会の“メタボロミクス温故知新”でイオン化の話をしてきた内容の一部を3回紹介してきました。

 

1回目:第65回質量分析総合討論会に参加して:イオン化温故知新、ESIFABの比較-1

 

2回目:第65回質量分析総合討論会に参加して:イオン化温故知新、ESIFABの比較-2

 

3回目:質量分析のソフトイオン化温故知新:ESIFABの比較-3

 

また4回目は、FABイオン化を用いたLC-MSインターフェース“Frit-FAB”について中心に書きました。

 

今回はその続編、使用していた時に注意していたノウハウ的な内容です。今回も図や写真の一部は、日本電子の松浦健二氏と旭川医科大学の阿久津弘明氏にご提供頂きました。冒頭でお礼申し上げます。

 

私がFrit-FABを主にLC/MSの応用研究をしていた19901995年当時、Frit-FABLC-MSの主流になり得なかった理由の一つはスプリット比の問題だったと思います。液体導入量が約5 µL/minに制限されていたため、コンベンショナルHPLCとの組み合わせにおいて、HPLCに注入した試料の殆どを捨ててしまっていたということです。そして、当時のFrit-FABにはもう一つ重要な問題がありました。それはfritのセッティングが難しかったことです。

 

下の写真と図は、第65回質量分析総合討論会で使用したものですが、これでFrit-FABのセッティングを説明します。

Frit-FABプローブ

 

先ず、キャピラリーチューブをプローブ(写真の白いロッド状の部品)に通します。キャピラリーの先端をカルレッツ製のセプタム(中心に孔が空いている)に通し、内キャップをかぶせてネジ部分で締め込みます。内キャップには中心に孔(7-8 mm位)があるので、内キャップを締め込んでいくと、孔からセプタムが盛り上がって出てきます。

Frit-FABのセッティングの一つ目のポイントは、この内キャップの締め込み具合です。イイ感じでセプタムを盛り上がらせることが重要です。そして、イイ感じでセプタムが盛り上がった状態の時、キャピラリーの先端をセプタム盛り上がりの頂上に面一で合わせます。

 

次に、セプタムの上にfritをおき、外キャップを被せて締め込みます。この時の力加減が二つ目の重要なポイントです。

三つ目の重要なポイントは、frit自体の質です。これら三つのポイントは、全てクロマトグラムのピーク形状を決める要因です。

 

fritはステンレス製の焼結フィルターなので、内部は編み目構造になっています。HPLCカラムで分離された成分は、セグメントの状態で溶離液と共に配管の中を流れてきて、fritの中を通過して表面に滲み出てきます。この時、fritの編み目構造が粗いと、表面に出てくるよりも前にfrit内部で拡散してしまい、クロマトグラムピークがブロードニングしてしまいます。イイ感じで目の細かい密や状態のfritを使うことが重要です。

 

一つ目のポイントである内キャップの締め込み具合や二つ目のポイントである外キャップの締め込み具合も、弱いとセプタムとfritとの密着度が下がるので、クロマトグラムピークがブロードニングします。また、強すぎると液の流れがスムーズにならなくなるので、感度が低下します。これは指先の感覚が頼りなので、当時も多くの人に伝授しようとしましたが、感覚って人に教えることが出来ないので、難しかったですね。fritの良し悪しの見極めについても、セプタム(面一で合っているキャピラリーの先端)から液が出ている状態でfritを指で押さえつけた時、液がfritの表面に即座に出てくるか、内部でじわっと滲むように動くか、を目視して判断します。液がfrit内部で滲んでしまうと、当然クロマトグラムピークがブロードニングしてしまいます。液の動きは約5 µL/minと微量ですから、この目視感覚もかなり個人差がありました。分からない人には全く分からなかったようです。

 

上記三つのポイントが全てパーフェクトな条件で、且つミクロHPLCを接続すると、以下に示すようなデータが得られました。これは、共同研究者が書いた論文ですが、データは勿論全て私が測定しました。

Frit-FAB論文_アルカロイド-1

Frit-FAB論文_アルカロイド-2

Frit-FAB論文_アルカロイド-3

 

この研究で使っていたHPLCは、当時では珍しいスプリット無しのプランジャータイプのポンプを使用していました。Micro-Tech Scientific社の製品で、日本ではフロンティアラボ株式会社が扱っていました。当時、購入したのか借りて使っていたのか...? 私の上司がフロンティアラボ㈱の社長と懇意にされていたので、借りて使っていたのかも知れません。

 

このミクロHPLCがまた大変な代物で、とにかく保持時間の再現性を得るのが大変でした。コンベンショナルHPLCの常識が全く通用しないのです。当時これと同じスプリット無しのプランジャータイプのミクロHPLCは、殆ど日本では稼働していなかったと思うので、他の装置と比較することもできないし、それこそ試行錯誤の連続でした。それでも何とか安定稼働する条件を見つけ出し、苦労に苦労を重ねて得られたのが、この論文のデータです。

 

自画自賛になりますが、このクロマトグラムは本当に美しいです。当時ミクロHPLCFrit-FABの組み合わせで、ここまで美しいクロマトグラムが得られた例は、少なくとも私は見たことがありません。今まで、恐らく10万を裕に超える質量分析のデータを自分自身で測定してきた中で、このデータは最良と称される部類に入ると思います。

 

検出限界も、セクターMSSIMモードでsub-fgに迫ろかというレベルでしたから、今の時代に持ってきても見劣りしないと思います。

 

以前から質量分析をやっている人は皆そうだと思いますが、一昔前の装置って、良いデータを安定的に得るためには、こう言う職人技が必要だったのです。良いデータを得るために色々と苦労して、時には装置をいじったりするから装置自体のことも良く解るようになる。色々と考えて創意工夫をしなければ、良いデータは得られなかった訳です。最近の装置しか知らない人には、こんな苦労話をしてもピンとこないと思いますが...

 

当時はレアで使いにくかったミクロHPLCも今ではルーティーンワークに使えるレベルにまで安定しているし、fritの歩留まりも今の加工技術であれば問題ないと思いますし、2つのキャップの締め具合も専用のトルクレンチを作れば誰でも良い締め具合で調整できるし、今の時代に合ったFrit-FABを創りたいなぁと常々思っています。自社だけでは開発費用がないので、大学や他企業との共同研究で外部資金を獲得する方法を模索するなどの工夫が必要になりますが。

 

 

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