逆相HPLCでのタンパク質分析にはやはり含TFA溶離液が有効:第317回液クロ懇に参加して

昨日(1121日(火)、317回液体クロマトグラフィー研究懇談会に参加して聴講してきました。講演主題は「ペプチドおよびタンパク質分析における最新技術」。幾つかのカラムメーカーさんが、ペプチドやタンパク質の分離分析のためのカラムや移動相条件についての話しをするようだったので、聴きにいきました。

 

以下、私が理解した範囲で概要を説明します。先ず、ペプチドやタンパク質を逆相カラムで分離する場合の、カラムに対する重要なポイントは以下の3点です。

・カラムのアルキル鎖(特にODS)密度と分析種の分子量

・カラムのアルキル鎖長と分析種の分子量

・充填剤の細孔サイズと分析種の分子量

 

ペプチドの分析であれば、一般的な低分子化合物を分析する時のカラムをそのまま使っても問題はないようですが、分子量が大きなタンパク質の場合、その大きさによって上記3点に注意した方が良い分離が得られます。

 

タンパク質分析では、カラムのアルキル鎖(ODS)の密度は、通常のものより低くなるように設計されているそうです。タンパク質は分子が大きいので、通常通りの密度でODSを結合させてしまうと、ODSの林の間にタンパク質分子が入り込めず、相互作用しづらいということです。もう一点は、移動相のグラジエント条件に関係します。タンパク質(ペプチドでもそうですが)分析では、水がほぼ100%の状態からグラジエント溶離を行う条件が一般的です。ODSの密度が高いより低い方が、水100%に近い状態の液体と馴染みやすいのは容易にイメージできます。

 

タンパク質分子は大きいので、ODSC18)ではアルキル鎖が長すぎてその全体をタンパク質分子との相互作用に使うことができないとのことです。そのため、よりアルキル鎖の短いC8C4の方がタンパク質の分析には適しているようです。

 

充填剤の細孔サイズも、やはりタンパク質分子の大きさが影響するようです。一般的な充填剤の細孔は10 nm前後ですが、大きなタンパク質分子は小さな細孔には入り込めないので、30 nm以上の大きな細孔サイズの充填剤がタンパク質分析には適しているようです。分子量10万を超えるような巨大なタンパク質には、100 nmの細孔サイズの充填剤が良いというお話しもありました。⇒ 参考資料(株式会社YMC技術資料)

 

 

また、これはコアシェルタイプのカラムの話しですが、多孔質層の厚さも重要なファクターであるようです。⇒ 参考資料(株式会社クロマニックテクノロジーズ技術資料)

 

次は移動相条件についてです。ペプチドやタンパク質分析のための移動相は、酸性条件が用いられることが殆どです。TFAやギ酸を水とアセトニトリルに添加し、グラジエント溶離を行うのが一般的です。濃度は0.1%程度。特にTFAが有効で、アミノ基とTFAがイオン対を形成するために、疎水性充填剤への保持が強くなります。

 

UV検出によるHPLCではTFAでもギ酸でも大差はありませんが、検出器に質量分析計(MS)を用いると話は変わってきます。0.1%TFAを添加した溶離液では、ESIにおいて分析種のイオン化を抑制してしまうため、LC/MSではTFAよりギ酸の方が使い易いと言えます。私の経験では、ペプチドはTFAをギ酸に替えても分離状態はそれ程変わりませんが、タンパク質の場合、TFAをギ酸に替えてしまうとピークがブロードニングするなど分離状態は悪くなる傾向にあります。昨日の講演の中でも、タンパク質の分析にはTFAが良いという話になっていました。

 

実は、TFAによるイオン化抑制の原理は、私自身はまだ良く理解できていません。多分、論文等にも書かれていないと思います。一般的には、TFAは酸性度が高すぎて、ESIのニードルと対向電極との間に流れる電流値が高くなり過ぎることが原因であるとされています。しかし、その電流値が高すぎると何故分析種のイオン化が抑制されるのかについては、突っ込んだ議論がないと思います。分析種を負イオンで検出する場合には、TFAによるイオン化抑制は単純に理解できるのですが、分析種を正イオンで検出する場合にも起こるので、両方を満足させる説明がなかなか出来ないでいます。引き続き考えていきます。

 

さて、上記のように、逆相カラムを用いたタンパク質分析のための移動相条件は、やはりTFAが良いようです。しかし、TFAはタンパク質の(正イオン検出による)イオン化を抑制する傾向があります(コンベンショナルESIの場合)。ペプチドのように、安易にギ酸に替えることも良くありません。

 

ではどうするか?

 

エムエス・ソリューションズでは、ソルナックCFOOによる脱TFAを提案します。タンパク質を分析したアプリケーションデータを見ると、ソルナックCFOOを用いることで、TFAをそのままMSに導入した場合と比べて34倍のシグナル強度増加が認められます。このことは、TFAによってタンパク質のイオン化が少なくとも6575%抑制されていて、ソルナックCFOOを用いることで、それが改善されたことを意味しています。

 

原理上、ソルナックCFOOにタンパク質が吸着することは有り得ません。TFAを溶離液に用いたタンパク質のLC/MS分析に、安心してお使い頂けます。なお、ソルナックには充填剤詰め替えタイプのカートリッジと、ディスポタイプのチューブがあります。

 

ご興味あれば、是非一度お試し下さい。

 

 

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