逆相HPLCでのタンパク質分析にはやはり含TFA溶離液が有効:第317回液クロ懇に参加して

昨日(1121日(火)、317回液体クロマトグラフィー研究懇談会に参加して聴講してきました。講演主題は「ペプチドおよびタンパク質分析における最新技術」。幾つかのカラムメーカーさんが、ペプチドやタンパク質の分離分析のためのカラムや移動相条件についての話しをするようだったので、聴きにいきました。

 

以下、私が理解した範囲で概要を説明します。先ず、ペプチドやタンパク質を逆相カラムで分離する場合の、カラムに対する重要なポイントは以下の3点です。

・カラムのアルキル鎖(特にODS)密度と分析種の分子量

・カラムのアルキル鎖長と分析種の分子量

・充填剤の細孔サイズと分析種の分子量

 

ペプチドの分析であれば、一般的な低分子化合物を分析する時のカラムをそのまま使っても問題はないようですが、分子量が大きなタンパク質の場合、その大きさによって上記3点に注意した方が良い分離が得られます。

 

タンパク質分析では、カラムのアルキル鎖(ODS)の密度は、通常のものより低くなるように設計されているそうです。タンパク質は分子が大きいので、通常通りの密度でODSを結合させてしまうと、ODSの林の間にタンパク質分子が入り込めず、相互作用しづらいということです。もう一点は、移動相のグラジエント条件に関係します。タンパク質(ペプチドでもそうですが)分析では、水がほぼ100%の状態からグラジエント溶離を行う条件が一般的です。ODSの密度が高いより低い方が、水100%に近い状態の液体と馴染みやすいのは容易にイメージできます。

 

タンパク質分子は大きいので、ODSC18)ではアルキル鎖が長すぎてその全体をタンパク質分子との相互作用に使うことができないとのことです。そのため、よりアルキル鎖の短いC8C4の方がタンパク質の分析には適しているようです。

 

充填剤の細孔サイズも、やはりタンパク質分子の大きさが影響するようです。一般的な充填剤の細孔は10 nm前後ですが、大きなタンパク質分子は小さな細孔には入り込めないので、30 nm以上の大きな細孔サイズの充填剤がタンパク質分析には適しているようです。分子量10万を超えるような巨大なタンパク質には、100 nmの細孔サイズの充填剤が良いというお話しもありました。⇒ 参考資料(株式会社YMC技術資料)

 

 

また、これはコアシェルタイプのカラムの話しですが、多孔質層の厚さも重要なファクターであるようです。⇒ 参考資料(株式会社クロマニックテクノロジーズ技術資料)

 

次は移動相条件についてです。ペプチドやタンパク質分析のための移動相は、酸性条件が用いられることが殆どです。TFAやギ酸を水とアセトニトリルに添加し、グラジエント溶離を行うのが一般的です。濃度は0.1%程度。特にTFAが有効で、アミノ基とTFAがイオン対を形成するために、疎水性充填剤への保持が強くなります。

 

UV検出によるHPLCではTFAでもギ酸でも大差はありませんが、検出器に質量分析計(MS)を用いると話は変わってきます。0.1%TFAを添加した溶離液では、ESIにおいて分析種のイオン化を抑制してしまうため、LC/MSではTFAよりギ酸の方が使い易いと言えます。私の経験では、ペプチドはTFAをギ酸に替えても分離状態はそれ程変わりませんが、タンパク質の場合、TFAをギ酸に替えてしまうとピークがブロードニングするなど分離状態は悪くなる傾向にあります。昨日の講演の中でも、タンパク質の分析にはTFAが良いという話になっていました。

 

実は、TFAによるイオン化抑制の原理は、私自身はまだ良く理解できていません。多分、論文等にも書かれていないと思います。一般的には、TFAは酸性度が高すぎて、ESIのニードルと対向電極との間に流れる電流値が高くなり過ぎることが原因であるとされています。しかし、その電流値が高すぎると何故分析種のイオン化が抑制されるのかについては、突っ込んだ議論がないと思います。分析種を負イオンで検出する場合には、TFAによるイオン化抑制は単純に理解できるのですが、分析種を正イオンで検出する場合にも起こるので、両方を満足させる説明がなかなか出来ないでいます。引き続き考えていきます。

 

さて、上記のように、逆相カラムを用いたタンパク質分析のための移動相条件は、やはりTFAが良いようです。しかし、TFAはタンパク質の(正イオン検出による)イオン化を抑制する傾向があります(コンベンショナルESIの場合)。ペプチドのように、安易にギ酸に替えることも良くありません。

 

ではどうするか?

 

エムエス・ソリューションズでは、ソルナックCFOOによる脱TFAを提案します。タンパク質を分析したアプリケーションデータを見ると、ソルナックCFOOを用いることで、TFAをそのままMSに導入した場合と比べて34倍のシグナル強度増加が認められます。このことは、TFAによってタンパク質のイオン化が少なくとも6575%抑制されていて、ソルナックCFOOを用いることで、それが改善されたことを意味しています。

 

原理上、ソルナックCFOOにタンパク質が吸着することは有り得ません。TFAを溶離液に用いたタンパク質のLC/MS分析に、安心してお使い頂けます。なお、ソルナックには充填剤詰め替えタイプのカートリッジと、ディスポタイプのチューブがあります。

 

ご興味あれば、是非一度お試し下さい。

 

 

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アジア最大の分析機器展示会“JASIS2017”に参加して!

968日、幕張メッセで開催された“アジア最大級の分析・科学機器専門展示会 JASIS2017に参加してきました。韓国のこの種の展示会に一度だけ参加したことがあるだけなので、JASISが本当にアジア最大級なのかは知りませんが、確かに規模は大きいです。4つのホールぶち抜きの会場、出展社数は500以上。出展社による技術説明会や関連学会等主催のセミナーも併設されていて、真剣に見て回ろうと思ったら1日ではとても足りないし、一人で全て見るのは物理的に絶対不可能。

 

前職の日本電子は理科学機器のメーカーなので、当然毎年製品を出展していて、私も勤めていたころは、アプリケーションや開発を担当する装置が出展される時は、説明員として装置の前に立っていたものです。技術説明やブース内のショートプレゼンをしたこともありました。前日のセットアップを合わせると4日連続で行ったことも... 懐かしい記憶です。

 

日本電子を辞めて今の会社“エムエス・ソリューションズ”を設立してからは、日本分析機器工業会(JAIMA)が主催するセミナー“これであなたも専門家LC編”で話すついでに半日程見学する程度で、1日のみ行くことが殆どでした。

 

ところが今年は...

 

前にブログで書きましたが、アルテア技研㈱様が総代理店をやってくれることになり、同社はフランスのIonBenchと言う会社の日本代理店でもある関係で、IonBenchの出展ブースに、弊社の会社案内と製品(LC/MS用脱塩カートリッジ・チューブ&バルブシステム)のパンフレット、および製品のポスターを展示させて頂きました。

 

会社案内 SALNAC Tube SALNACカートリッジ_20170830 e-SALNAC

この4枚をA3に印刷、半分に折って見開きのパンフレットを作って頂きました。

 

ってことで、恐らくは10年以上ぶりに3日間フル参加。中日の午後はJAIMAセミナーで話しましたが、それ以外は脱塩カートリッジ&チューブ開発担当の清水と交代しながら、IonBench(アルテア技研㈱)社ブースに説明員として立っていました。ブースに居た時間は、清水が7割で私は3割という感じでしたが。

 

アルテア技研㈱のブース説明員の皆さん、IonBench社の製品を説明するついでに、我々の製品説明も一生懸命してくれていました。人によってはまだ殆ど知識がないし、当然難しい質問には対応できないので、そんな時には我々に振って貰って。脱塩カートリッジ・チューブ共に基本的には消耗品で低価格、特にチューブは単価が安いので、とりあえず使って見ようという反応が結構あったらしく、JASIS2017のあと早速何件か購入して頂きました。JASISの前から既にお客様に紹介してくれていた営業の方もいました。2人だけの会社で営業に行くなんて早々できないし、今まではホームページが主力の販促ツールでしたが、やっぱり営業の力は大きいですね。

 

勿論、直販の方が売り上げに対する利益率は大きい訳ですが、ネットだけの販促には限界がありますから、やっぱり人による営業は必要。自分達にそれが出来ないのであればアウトソーシングするしかない訳で、我々は我々でやるべきことに集中し、アウトソーシングできることは外に任せる。零細企業は勿論、大きな規模の会社でも、自分達にできないこと(得意でないこと)はアウトソーシングを使うという考え方、これからの企業には大切だと思います。これについては、また別の機会にかいてみようと思います。

 

そうそう、確か3日目だったと思いますが、ブースに立っていた時のこと、一人の女性が私を見て近づいてきました。“どこかで会ったことある人かなぁ?”と思いつつ、持っていたパンフレットを渡して話しかけてみたら、“以前から質量分析のブログ読んでいます!”ですって♪ ブログを書き始めてから、今までにも何回かこう言うことがありました。ブログを書いていることで直接仕事に結びつくことは少ないですが、人様の役に立っているようなので良しとしましょう。

 

質量分析の専門的なネタでブログを書く時は、間違ったことはかけないので、かなり時間をかけて推敲して書いています。なので、毎日更新って訳には行きませんが、これからも継続して書いていこうと思います。

 

 

 

 

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第310回液体クロマトグラフィー研究懇談会

今日の午後、(株)島津製作所東京支社において、第310回液体クロマトグラフィー研究懇談会が開催されました。

 

主として装置メーカーの方から、LC/MSのデータ解析に用いる最新技術・ソフトに関するお話がありました。

 

私も、マススペクトル解析に関する話をしました。様々な解析ソフトを使う中でも、生データをしっかり見ることが重要だという話をしました。LC/MS分析をしている人で生データをしっかり見る習慣のある人ってかなり少ないので、内容としては難しかったかなぁと思います。

一方で終了後に、¨高橋さん今日の話勉強になりましたよ¨と言って頂くと、大変励みになりますね!

これからも、質量分析の本質を伝える仕事をし続けたいと思いました。

 

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質量分析インフォマティックス研究会第二回ワークショップに参加して

2/24の午後、表題の「質量分析インフォマティクス研究会第二回ワークショップ」に参加してきました。

プログラムなどは、こちらをご参照下さい。

 

インフォマティクスなどという言葉(研究分野)は、私が質量分析を始めた頃には無縁でした。

その頃の質量分析については、こちらで少し書いています。

 

何しろマススペクトルデータがアナログですから、一人が一台の質量分析計で測定できる検体数は、どんなに頑張っても10検体くらい。

しかも試料導入法は直接導入しかありませんでしたから、単離精製した化合物を測定していて、1検体1化合物でした。

(例えば天然物試料をLC/MSで測定すれば、1検体100以上の化合物です)

 

質量分解能は低く同位体ピークが分離できる程度、MS/MSはありませんでした。

イオン化法は電子イオン化(electron ionization, EI)のみ。

マススペクトルから得られる情報は少なく、当時はまだパソコンも普及していませんでしたし、方眼紙に定規と鉛筆でマススペクトルを書いて、

フラグメンテーションの解析も電卓片手に手書きでした。それで何とかなっていました。

 

しかし、今はパソコンの性能が上がってデータ測定のスピードがあがり、1検体100以上の化合物から成る試料を1日に数百検体も測定できてしまいます。

質量分析計の性能も向上し、特に分解能についてはTOF-MSで30,000以上、FTを使う装置では100,000以上が容易に達成できます。

MS/MSが可能な装置も増えています。マススペクトルから得られる情報量が桁違いに多くなっていて、とても人の手と目、頭だけでは処理できなくなっているのが現状でしょう。

 

私自身、お客様からの依頼で天然物のLC/MS/MS測定&マススペクトル解析をすることがありますが、マススペクトル解析支援ツールやデータベースを活用しています。

 

そんな訳で、今回は知り合いから教えて貰ったこのワークショップに参加してみました。

演者の中に二人知り合いがいたというのも、参加の決めてにはなりました。

 

未知化合物の構造推定を質量分析を用いて行う場合、高分解能のMS/MSが必要なのは言うまでもありません。

そのデータから以下に構造を推定していくか...

完全に未知化合物の場合には、よほど運が良くないと、何等かのデータベースやツールを使わざるを得ないと思います。

前に解析した化合物とマススペクトルが似ているとか...

 

イオンの精密質量情報から、元の分子の元素組成を一義的に決められるという前提の基に、今は以下のアプローチがあると思います。

  1. 1. MS/MSにより得られるマススペクトル(プロダクトイオンスペクトル)のデータベースで検索する

2. 推測した化合物の構造からフラグメンテーションを予測し、実測のプロダクトイオンスペクトルと比較する

3. 有機化合物データベースに登録されている化合物の構造からコンピューターでフラグメンテーションを予測し、実測のプロダクトイオンスペクトルと比較する

 

1については、一般的に使えるデータベースへの登録化合物数が非常に少ないので、よほど運が良くないとマッチすることは無いでしょう。日々データ数は増えているので、将来的には期待できます。

2については、そもそも未知化合物のマススペクトルと精密質量情報から、”この化合物はこんな構造だ”などと推測することは先ず不可能なので、医薬品の代謝物や、天然物であれば既知成分の類縁体など、かなり限られると思います。

3については、私自身も最も期待していますし、これから益々需要が伸びてくる方法だと思います。今は、MetFragというWebツールを主に使っています。今回のワークショップでは、理研の津川氏がその方法で解析ツールを開発していて、今回もそのお話しをされていました。私は、津川氏のお話しは今までに4~5回は聞いていて、直接お話ししたことも何度かあります。もともとは質量分析の専門家ではないとのことですが、有機イオンのフラグメンテーションについてとても良く勉強されていて、彼の開発しているツール(MS-FINDER)は最近使い始めました。MetFragの方が、私にとっては手軽に使えるのですが、今後はMS-FINDERを使い込んでいこうと思っています。MS/MSにおけるフラグメンテーションは、切れやすいところから切れる(結合エネルギーの小さな結合ほど開裂し易い)という基本原則はありますが、単純に開裂するだけでなく、転位反応や再配列などを伴う開裂もあるし、イオン-ニュートラルコンプレックスを経由して起こる開裂もある。置換基効果や同位体効果までも考慮すると、構造からフラグメンテーションを予測するというのは、実際には非常に難しいことだと思います。実際、上記2では、経験則に基づいて構造からフラグメンテーションを予測してくれて、私も使ったことがありますが、実測のイオンと合わない予測フラグメントイオンが沢山出てきて、余り役に立たない印象です。3でも、構造からフラグメンテーションを予測することは同じですが、その予測にどのようなフラグメンテーション上の情報を加えていくかが重要なのだと思います。津川氏は、そのような情報(例えばマスシフト則とか)を加えて実装を工夫されているようです。

 

ワークショップでは、その他には、沖縄科学技術大学院大学の早川氏の話は面白かったですね。やはり、プロダクトイオンスペクトルから低分子化合物の構造を推定するためのツールを開発していますが、アプローチがとても興味深かったです。”似た構造の化合物はプロダクトイオンスペクトルも似ている筈”という考えの基で、ある試料のLC/MS/MS測定から得られた複数のプロダクトイオンスペクトルの類似性からクラスタリングを行い、精密質量から得られた元素組成からデータベース検索を行い、クラスタリングしたグループでデータベース検索結果の中に共通の部分構造を有するものがあれば、それがそのクラスタリンググループの共有構造に近い筈、という考えに基づいて未知化合物の構造推定を行うという方法のようです(全ては理解できませんでした)。

 

私も質量分析屋ですから、日本の研究者の方が開発しているツールは使い込んで行って、質量分析屋として開発に協力できることがあれば協力したいと思います。

 

 

現場でのLC/MS分析サポートや技術指導、マススペクトル解析サポート、インハウスセミナーのご依頼は、ホームページのお問合せからどうぞ!

 

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LCテクノプラザ講演募集を延長して受付中!

1月19―20日の2日間、横浜情報文化センターで、第22回LCテクノプラザが開催されます。

http://lckon.sakura.ne.jp/lctech/lctec22.html

 

液体クロマトグラフィー研究懇談会(液クロ懇)主催の、年1回のイベントです。

 

学会形式ですが、発表には学術的な新規性は特に求められません。LCやLC/MSの分析ノウハウや失敗例、仕事内容など、何でもオッケーです。他学会等で発表済みのネタでも構いません。

 

講演募集期間を延長していますので、ご興味ある人はお気軽に申し込んで下さい。

 

私は、二日目最後の基礎講座でLC/MSの話をします。弊社スタッフの清水は、オンライン脱塩装置に関するポスター発表をします。また、オンライン脱塩装置のカタログ展示も行います。

 

 

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ワークショップで議論に参加しない人から欲しい情報が得られないと苦情を言われても...LC/MSワークショップでの例

この記事は、参加者が議論に参加することを求められるワークショップに参加して、聴くだけで議論に参加しないのみならず、自分の欲しい情報が得られなかったと苦情を言ってきた、残念な人の話です。チョッと長いです。

 

先週(1027日午後-28日夕方)、静岡県掛川市(ヤマハリゾートつま恋)で行われた第8LC/MSワークショップに参加してきました。12日、LC/MSに関して2日間集中的に議論しようってイベントです。

LC/MSは、質量分析学会が発刊しているマススペクトロメトリー関係用語集にもありますが、液体クロマトグラフィー質量分析(liquid chromatography mass spectrometry)の略語です。

 

ある製薬企業や大学等でLC/MSを使っている、あるいは研究している人達が集まって、業界全体でLC/MS分析の際に問題になっていることを議論する場です。会場の雰囲気はこんな感じ。

dsc_1709

 

私は初回から参加して、第2回目からは世話人としてプログラム検討などに関わっています。

 

今年の議論の中心は、「LC/MSを用いたタンパク質の定量分析」と、「エレクトロスプレーイオン化の時に問題となるマトリックス効果」の二本柱。タンパク質の定量分析については昨年度初めて話題として取り上げ、最近製薬業界でホットになりつつあるということで、今回は本格的に話題にしました。

 

世話人の人達は、製薬企業の研究員の方が4名ほど、大学教授(教員)が2名、そして私。私はこのイベントで世話人をやっても会社の営業には意味がないので、事実上自己費用で参加しています。他の方達は会社や大学の経費で参加していますが、それでも世話人の集まりが平日に年数回ありますから、その分の人件費やその都度の交通費(遠方から来る人は宿泊費も)は会社なり大学なりが負担している訳です。世話人の集まりでは、その年の話題を検討したり、参加を呼び掛ける企業をどうするか・何かの検証実験が必要かなどを議論したり、必要に応じて自分達で実験をしたり、まぁ楽しい集まりではありますが結構な時間拘束されます。

 

一方で、一般の参加者(多くは製薬企業の研究者)は、当日2日間のみの参加ですから、会社の費用負担は、世話人を輩出している会社に比べると圧倒的に少ない訳です(大企業にすれば何れも大した額ではないのかも知れませんが...)。

 

ワークショップ・セミナー・講習会・講演会など、似たようなイベントで色々な種類があります。それぞれの違いを正確に説明することは出来ませんが、ワークショップは、ただ演者の話を聴くだけでなく、参加者自ら体験したり議論に参加したり、っていうイメージが強いです。そして、このLC/MSワークショップも、事前に参加者に送る開催趣旨には、参加者資格として「積極的に議論に参加できる人」と謳っています。業界全体で起こっている問題について、議論を交わすことで解決策を探ろうって集まりですから、“ただ参加して聴いて情報収集して帰ろう”って人にはむしろ参加して欲しくない訳です。

 

でも、毎年こういう人は必ず数名は居るのです (>_<)

 

今年も残念ながらいました。

特に印象に残った、冒頭に触れた人(Aさん)のことを書いておきます。

 

今回から新たに世話人に加わった方の発案で、「LC/MSを用いたタンパク質の定量分析」に関する事前アンケートを、製薬企業からの参加者に対して実施しました。現場で問題になっていることやその解決策を書いてもらいました。Aさんの回答にも、沢山の問題や困っている事が書かれていました。

 

Aさんは、会の中で自ら発言したり議論に参加したりすることはありませんでした。世話人の一人が議論の中で、Aさんに発言を促したことがあり、その時に一回だけ質問を投げかけていました。

 

そしてワークショップ終了時にも、会に参加してみてのアンケートを実施します。事務局が早速それを集計してくれて、世話人には直ぐに配布されるのですが、Aさんのアンケート用紙には

 

・世話人からの発言や質問が多く、参加者からは少なかった

・欲しい情報が得られなかった

・事前アンケートに沢山質問を書いたのに取り上げられなかった、真面目に書いて損した

 

などと書かれていました。

 

だったらもっと自ら発言しなさいよ!

自分の疑問点が話題になるように議論に参加しなさいよ!

って話です。

 

この記事では、特に印象に残ったAさんに特化して書きましたが、同様な方は何名かいました。また、学会の関係でこのような集まりに参加すると、同様な挙動をされる方は必ずと言っていい程います。

 

知識や経験の少ない初心者の方であれば、このような場で議論することはハードルが高いと思いますが、そのような方はそれに相応しい場(初心者向けセミナーなど)に行けば良い訳で、今回のようなセミナーに参加することは、自分の利益しか考えない迷惑行為であることを認識して頂きたいです。

 

これは、企画する世話人サイドにとっても課題なので、来年度以降の改善案を世話人会に(メールで)提案しました。

 

このLC/MSワークショップ、議論の内容はかなり濃いので、議論や情報提供ができる方(企業)には絶対お勧めできるイベントです。参加者は、基本的に世話人からの呼びかけによって集めており、一般には参加者を募集していないので、来年度の参加をご希望される方は、エムエス・ソリューションズのホームページ/問い合わせからご連絡ください。

 

このような真面目な会ではありますが、初日の午前中には有志でテニスをしたり、また初日夕方の自由時間には施設内の3 kmコースを走ったりと、アクティビティー面でも充実した内容でした。

dsc_1708dsc_1711

 

尚、今回会場となったヤマハリゾートつま恋さん、今回含めて7回お世話になっていますが、年内で営業を終了そうです。とても良い施設だったので残念です。

 

LC/MSに関する技術指導、インハウスセミナーなどのご依頼は、以下のURLからお願いします。

 

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