質量分析原理など

第2回LC/MS分析士二段試験問題解説書

日本分析化学会が毎年行っているLCおよびLC/MS分析士試験。初段~五段までがあり、初段~三段はマークシート形式の筆記試験です。LCおよびLC/MSの初段から三段まで、各3回分の試験問題の解説書を、分析化学会から出版する予定であり、最近第2回目のLC/MS分析士二段試験問題の解説書が出版されました。50問分の解説のうち、私は7問分を執筆しました。LC/MS分析士試験を受験する人の勉強用としては勿論ですが、参考書としても良い本だと思います。

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エレクトロスプレーイオン化の基礎:イオン源の変遷その2

以前の投稿で、日本に初めてエレクトロスプレーのイオン源(ESイオン源)が入ってきた頃の事を書きました。初期のESイオン源は、とてもじゃないけどLC/MSに使えるような代物ではありませんでした。図1に初期のESイオン源を示します。

 

 初期のESイオン源

1 初期のESイオン源

 

ESILC/MSのイオン化法として汎用的に用いられるようになったのは、①大量の液体を帯電液滴にする、②帯電液滴の脱溶媒効率を向上させる、③大気圧で生成したイオンをロスなく質量分離部まで運ぶ、の3つの技術開発に依ると思います。

 

①を可能にしたのが“空圧ネブライザー”です。以前の投稿で書いた様に、図1に示した初期のESイオン源では、導入できる液体流量は5 µL/min程度以下でしたから、直結できるLCはミクロLCだけでした。しかし、当時は、現在のようにナノLCやミクロLCは普及していなかったため、ESILC/MSのイオン化として普及させるためには、汎用LC(内径4.6 mmカラム、移動相流量1 mL/min)との直結が必要でした。

 静電的な作用のみでは帯電液滴に出来ない大量の液体を如何に液滴にするか?

その技術開発に、各メーカーがしのぎを削っていた時期がありました。加熱ネブライザー、超音波ネブライザーなど、様々な技術が開発されては消え、最終的に現在の空圧ネブライザー即ちガスの圧力によって液滴を生成させる方法に落ち着きました。

 

②帯電液滴の脱溶媒も非常に重要でした。液体流量が5 µL/minの時と1 mL/minの時では、当然ですが液滴のサイズと溶媒量が大きく異なりますので、空圧ネブライザーによって生成した帯電液滴を乾燥させるためには、強力な加熱デバイスとの組み合わせが必要でした。加熱チャンバー、加熱したガスを吹き付けるなど、こちらも様々な方法が開発され、現在でもメーカーや機種に依って異なる方法が用いられています。

 

③大気圧で生成したイオンをロスなく質量分離部まで運ぶ事を可能にしたのは、“高周波電圧を使うデバイス”の開発に依るところが大きいと思います。イオンガイドやイオンファンネルなどの高周波デバイスは、差動排気の中段、真空度がまだ高くない領域に配置され、イオンを進行方向に殆ど加速させることなく、高周波電圧によってイオンを収束させながら次のステージに導くことが出来る技術です。これら高周波デバイスが搭載されたESイオン源を初めて使った時の感動は、今でもはっきり覚えています。

 

当時の日本電子では、大型のSector-MSFrit-FABESIなどを装着してLC/MSを行っていました。私も、AB社が開発した初期のESイオン源を使った事があります。検出されるイオンの様子はオシロスコープで確認するのですが、イオン生成が非常に不安定で強度も低く、プロファイルが形になりませんでした。

 

加えて、地味だけど忘れてはならない改良点は、ネブライザーの方向とイオンの取り込み方向を直交あるいは軸ずらしにした事です。初期のESイオン源や、今でもナノESIではそうですが、スプレイヤーとイオン取込孔が同一軸上に配置されています。液体導入量が少なく、静電的な作用のみで帯電液滴が生成する場合、液滴のサイズが小さく電荷密度が高いため、この配置でも実用上問題ありません。しかし、空圧ネブライザーによって生成する帯電液滴は、サイズが大きく且つ電荷密度が低いため、スプレーの中心部分は脱溶媒仕切れない液滴や電荷をもたない中性粒子が大量に存在します。そのような状況でスプレイヤーとイオン取込孔が同一軸上に配置してしまうと、イオン以外の“余分なもの”が質量分析計内部に侵入してしまい、ノイズレベルが上がる原因になります。そのため、空圧ネブライザータイプのESイオン源では、主に直交スプレーが採用されています。

 

最近のESイオン源の一例を図2に示します。

 

空圧ネブライザータイプのESイオン源

2 空圧ネブライザータイプのESイオン源

 

空圧ネブライザー(+静電的な作用)によって生成した帯電液滴は、サイズが大きく電荷密度は低い状態です。質量分析計内部に取り込まれるのは単分子イオンのみで、それは電荷反発によってスプレーの外側に広がるため、直交スプレーは外側に存在する単分子イオンを取り込むのに有利な配置と言えます。

 

現在の空圧ネブライザータイプのESイオン源は、帯電液滴からのイオン生成の効率が悪い事が最大の弱点です。

 

Waters社が開発したUniSprayTMは、高電圧を印加しない空圧ネブライザーによって中性の液滴を生成させ、それを、高電圧を印加したターゲットピンに衝突させ、液滴を破砕させると当時に電荷を与えるため、通常のESIよりも小さくて電荷密度の高い帯電液滴を生成させることが可能です。感度、汎用性共に通常のESIを凌ぐイオン化法として、今後期待される技術です。

http://www.waters.com/waters/ja_JP/UniSpray-ion-source%2C-an-alternative-to-ESI%2C-APCI-and-APPI/nav.htm?locale=ja_JP&cid=134891755

 

また、ESIAPCIあるいはESIAPPIを組み合わせたコンビネーションによるイオン化法も、空圧ネブライザータイプのESIの弱点を補う技術と言えるでしょう。

 

我々が開発中の軟X線重畳ESIについても、ESI+APPIに近い技術ではありますが、特長のある新しいLC/MSイオン化法です。

 

今後も、ESIを基本として改良を加えたLC/MSイオン化法が開発されると考えています。

 

 

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In silicoでのMS/MSマススペクトル解析支援ツール:MS-FINDER

お客様からのご依頼で、植物など天然物由来成分(基本的には未知化合物)の構造推定をする事があります。高分解能MS/MSで得られたマススペクトル(プロダクトイオンスペクトル)を解析するのですが、その時に重宝しているのが理研で開発された“MF-FINDER”というソフトです。

 

以下のサイトからダウンロード(フリー)して、PCに保存して使用します。PCのセキュリティー環境に依っては、ダウンロード出来ない場合もあるようです。

MS-FINDER

 

このソフトは、メタボロミクス用に開発されたもので、代謝物を中心に低分子有機化合物が登録されているWebデータベースから、[M+H]+[M-H]の精密質量を元に対象となる化合物を選択、その構造から、定義された規則に基づいて予測フラグメントイオンを生成させ、それを実測のフラグメントイオンと比較し、一致度の高い化合物を教えてくれるものです。

 

以下は、アミノ酸の一種であるアルギニンのプロダクトイオンスペクトルを処理した結果です。青いスペクトルが実測、赤いスペクトルが予測です。m/z 130.0976は予測出来ていませんが、他は一致しており、アルギニンが一位でヒットしています。

MF-FINDER_Arginine

 

MS/MSは低エネルギーCIDによるものを前提としており、開裂し易い結合エネルギーの低い結合を優先的に切る仕様です。開裂に伴う水素転位やマスシフトは、かなりしっかり予測できています。

 

勿論、完全なものではありませんが(そもそもこの世に完全なものなど無い)、かなり有効なツールです。今月28日に株式会社島津製作所東京支社で開催される第324回液体クロマトグラフィー研究懇談会で、このソフトに関連する話しをします。上の例で、m/z 130.0976が予測出来ていない理由など、もっと詳しい話しをしますので、質量分析を使って低分子化合物の構造推定を行っている人など、興味ある人は是非聴きに来てください。

 

マススペクトル解析支援などのご依頼は、ホームページのお問合せからどうぞ。

 

 

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マススペクトル取得モードについて

質量分析計をお使いの皆さんは、マススペクトル取得モードについて意識されたことはあるでしょうか?

 

マススペクトル取得モードは、大きく分けて二つ。ProfileモードとBarモードです。ただし、メーカーや機種によって、名称は異なる場合があります。Profileモードでは、所謂生データの状態でのマススぺクトルが得られます。一方、Barモードでは、Profileモードで保存されたマススペクトルの全てのピークを棒状に変換した状態でマススペクトルが得られます。

 

私達が通常目にするマススペクトルの横軸はm/zmはイオンの質量を統一原子質量単位で割った値、zは電荷数)ですが、質量分析計が実際に計測しているのは、飛行時間質量分析計であれば飛行時間、四重極質量分析計であれば電圧です。何れの場合においても、マススペクトルの取得には一定の時間を要するため、m/z軸は、元々は時間軸であると考えることが出来ます。ある時間間隔において検出器で検出したイオン量(電流量)を時間軸に対してプロットし、横軸を、m/zに変換したチャートがマススペクトルです。

1Profileモードで取得したマススペクトルのイメージですが、m/z軸に対して一定間隔のデータポイントをもっています。Profileモードのマススペクトルに対して、ノイズを除去するための閾値やピーク幅などの条件を設定してピークを検出し、ピークトップや重心をピークの位置として棒グラフに変換したチャートが、図2に示すBarモードのマススペクトルです。測定条件において、マススペクトル取得をBarモードに設定していても、データ処理システム内部では、一旦Profileモードのマススペクトルがメモリーに記録され、それをBarモードのスペクトルに変換してハードディスクに保存しています。

スペクトル取得_図1

図1 Profileスペクトルのイメージ

 

スペクトル取得_図2

図2 図1のProfileスペクトルから変換されたBarスペクトルのイメージ

 

 

私がお客様のところへLC/MS技術指導でご訪問した時、両モードの違いを意識せず、Barモードの設定で使用されているケースが多々あります。私はそれらのケースの殆どにおいて、Profileモードでのマススペクトル取得を推奨しています。

 

その最大の理由は、

“Barスペクトルは加工されたスペクトルである”

と言う事です。加工されたスペクトルである以上、元の状態を正しく知る事は出来ません。例えば、以下に示すような不具合が起こっている事を100 %は否定出来ません。

 

3に示すように、何等かの理由で、マススペクトル取得時にm/z 60付近にスパイクノイズが入ったとします。Profile Barへの変換におけるパラメーター設定において、スパイクノイズはピークと見なされず無視される事もありますが、ピークとして認識されてしまう可能性を100 %否定する事は出来ません。そして、スパイクノイズがピークとして認識されてしまうと、Barへ変換されてしまうため(図4)、ノイズが恰もピークであると言う誤った認識をしてしまう事になります。

また、図3m/z 100付近に未分離のショルダーピークが検出されたとします。Profile Barへの変換におけるピーク分離に関するパラメーター設定において、このショルダーピークが認識されないと、Barへ変換される際に無視されてしまいます。

スペクトル取得_図3

図3 スパイクノイズや未分離ピークが観測されているProfileスペクトルのイメージ

 

スペクトル取得_図4

図4 図3のProfileスペクトルから変換されたBarスペクトルのイメージ

 

Profileスペクトル → Barスペクトルへの変換技術は、私が質量分析計を使い始めた頃にはまだ普及していませんでした。何しろ、ペンレコーダーにマススペクトルを記録していましたから、マススペクトルは全てアナログデータでした。この技術が普及し始めたのは、コンピューターによる質量分析計の制御や測定、データ処理が可能になり、GC-MSが登場した頃だと思います。

 

GC-MSが登場する以前は、質量分析計への試料導入は全て直接導入でしたから、マススペクトルの取得スピードは、5秒/枚とか10秒/枚とか、ゆっくりで良かった訳です。そして、1試料に対して得られるマススペクトルは1枚。これが基本でした。測定時間も、数秒から長くても1分程度でした。しかし、GC-MSが登場すると、クロマトグラムピーク幅に合わせたマススペクトル取得スピードが要求されるようになり、0.10.2秒/枚のマススペクトル取得、測定時間も数十分にもなります。例えば、マススペクトル取得を0.2秒/枚、測定時間を30分とすると、一試料に対して取得されるマススぺクトル総数は9,000枚にもなります。GC-MSが登場した頃のコンピューターと言えば、ハードディスやメモリーの容量は現在からは考えられない程小さく、保存媒体はフロッピーディスクやMOディスクが主流でした。

そのような小さな容量のハードディスクに、Profileモードで取得した大容量のマススペクトルデータを大量に保存できる筈はなく、Profileスペクトル → Barスペクトルへの変換技術は、当時のGC-MSには必須でした。

 

最近の質量分析計は、マススペクトル取得スピードは高速化し、そもそも検出系の改良でデータポイントの間隔も小さくなり、Profileモードで取得したマススペクトルのデータ容量は以前に比べて大きくなってはいます。しかし、それ以上にコンピューター自体の進歩が凄まじいため、GC/MSLC/MSのデータをProfileモードで取得する事は、全く問題ないレベルになっています。

 

Barモードは、既に加工されたマススペクトルのみしか得られず、生データを確認できないと言うデメリットを考えると、マススペクトルの取得は、基本的にはProfileモードにするべきだと考えます。

 

 

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アミノ酸の[M-H]-イオンのMS/MSスペクトル解析

最近、必須アミノ酸20種類の低エネルギーCIDによるMS/MSスペクトルを解析していますが、帰属するのに骨格転位を伴う開裂を考えないと説明できないイオンがたまに出ます。先ずは、In-Silicoのフラグメンテーション予測ツールを使いますが、骨格転位を伴うと考えられるイオンは、先ず予測されません。特に、負イオン([M-H]-)の開裂は参考例も少なく、解析に苦労します。まぁ、時間がある時に1つずつ丁寧に見て行こう。

 

 

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チョッとレアな(?)イオン化法、イオンアタッチメントについて

以前から何度か書いていますが、質量分析計による測定の基本は、第一に化合物に適したイオン化を選択することです。

 

揮発性(加熱して気化する性質)化合物に適したイオン化として、先ずは電子イオン化(electron ionization, EI)、そしてEIでは分子イオン(分子から電子が1つ取れたイオン)が得られず、分子内の結合が切れて断片化イオン(フラグメントイオン)が観測されてしまう場合には化学イオン化(chemical ionization, CI)が有効であると解説しました。

 

通常、市販されている質量分析計で、揮発性化合物に有効なのはこの2つのイオン化法ですが、今回はそれ以外の方法として、イオンアタッチメント(ion attachment, IAを紹介します。IAは、気相分子に金属イオン(Li+)を付加させることで、フラグメントフリーのイオンが観測されるイオン化法です。

 

以前は、キャノンアネルバで事業化していましたが、数年前に止めてしまいました。キャノンアネルバはIA部分を開発しており、質量分析計に日本電子の四重極質量分析計を採用して、コラボしていました。そして、キャノンアネルバのIA-MSのアプリケーション担当者が、群馬大学工学部時代の同期の女性で、当時私は日本電子に居ましたが、同じ業界に大学の同期がいた事にとても驚きました♪

 

私自身、IAは使ったことがないのですが、イオン化としてはアンモニアを試薬ガスに使うCIに近いのかなぁと思います。CIでは、主としてイオン化した試薬ガス(試薬イオン)から気化した分析種分子にプロトンが移動してプロトン付加分子([M+H]+)が生成し、IAはリチウムイオンが気化した分析種分子に付加してリチウムイオン付加分子([M+Li]+)が生成します。CIでプロトン移動により分析種分子がイオン化するのは、試薬ガスとしてメタンやイソブタンを用いた場合であり、試薬ガスとしてアンモニアを用いた場合、分析種分子にアンモニウムイオンが付加した([M+NH4]+)が主として生成します。

・揮発性化合物に有効であること

・イオン化の際にフラグメントイオンが生成し難いこと

・付加イオンが生成すること

の3点において、IACIと共通点があります。

 

試薬イオンと分析種分子とのプロトン移動によるイオン化では、両者のプロトン親和力が重要です。試薬イオンより分析種分子の方がプロトン親和力が高ければ、分析種分子にプロトンが付加したイオンが生成しますが、逆の場合、すなわち試薬イオンより分析種分子の方がプロトン親和力が低ければ、プロトンは移動せず、分析種分子はイオン化しません。

一方、IAやアンモニアを試薬ガスとして用いるCIでは、分析種分子にLi+NH4+を受け取る性質があれば、分析種由来のイオンが生成するため、プロトン移動によるCIよりイオン化効率は高いと考えられます。

 

では、IAとアンモニアを試薬ガスとして用いるCIではどちらが良いのか?

 

イオン化法は、それぞれ相補的に使うものなので、何かをもってどちらが良いなどと比較する事に余り意味は無いと思いますが、同様な目的で使うのであればイオン化効率の高さは非常に重要でしょう。分析種分子に何かのイオンが直接付加することで分析種分子がイオンになる場合、その付加するイオンの反応性がイオン化効率において支配的である筈です。とすれば、Li+NH4+のどちらが反応性が高いか? 単分子分解でない限り、反応には相手が必要なので、この場合の反応性も相手になる分析種分子との反応性という事になり、結局は相手(分析種)次第、LC/MSにおけるESIAPCIの関係の様に、分析種の性質に応じて使い分けるという事になるのでしょうか!?

 

IAは、現状LC/MSのイオン化法としては使えない様なので私の専門からは外れますが、IAに関して研究している、飲み友達でもあるTさんが何かコメントしてくれるかな?(^o^)

 

 

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