質量分析原理など

偶数電子イオンのフラグメンテーション-3:マスシフト則(±0と+2)の例

LC/MS/MSによるプロダクトイオン分析で対象となる偶数電子イオンのフラグメンテーションの3回目、今回はマスシフトを伴う例について解説します。偶数電子イオンのフラグメンテーションにおけるマスシフトについてはまた別の機会に紹介しますが、直ぐに知りたい方は、故中田尚男先生が論文にまとめられていますので1, 2)、そちらを読んでください。前回に続き、アルギニンのプロトン付加分子([M+H]+)のプロダクトイオンスペクトル(図1)から、典型的な例を示して解説します。

Arg prodact ion spctrum

図1 アルギニンのプロトン付加分子のプロダクトイオンスペクトル

 

フラグメンテーションに関する基本的な考え方の一つに、¨フラグメントイオンと脱離する中性フラグメントは、両方とも有機化学的に安定な構造である¨、という事があります。今回の解説は、その事が特に重要になります。

 

1で観測されているm/z 116, 60イオンの生成について、推定フラグメンテーションを図2に示します。

 

Arginine Fragmentation_+2H

図2 アルギニンのプロトン付加分子からのm/z 116, 60イオンの推定生成過程

 

2回目の記事と同様、イオン化の際にプロトンが付加するのは2つの1級アミノ基のどちらかですが、低エネルギーCIDによって励起状態になった際にプロトンが移動し、グアニジル基の根元の窒素に移ったとき、このフラグメンテーションが起こると考えられます。正電荷に対して隣のC-N結合の電子が2つとも動くと、炭素は電子を1つ失った状態になるため、正電荷をもちm/z 116イオンが生成します。このイオンはそのままの構造で安定であるため、マスシフトは±0です。これは、以前の記事に書いたアンモニア脱離と水脱離によって生成するイオンと同じです。

一方、同じ結合の電子が1つだけ正電荷に向かって動くと、グアニジル基側が正電荷をもちます。しかし、これはラジカルカチオンで構造的には不安定なので、このままでは検出されません。このイオンが安定化するために水素が結合し、結果としてm/z 60イオンが生成します。偶数電子イオンのマスシフト則は、イオン化していない中性の構造において結合を切断し、その構造と実際に検出されるイオンとの質量(m/z)差を示すので、ここで取り上げたm/z 60イオンについては、マスシフトは+2となります。マスシフトは、主として生成するフラグメントイオンを安定化させるために起こると考えられており、この事はフラグメンテーションを考える上で重要ですので、是非知っておいてください。

 

文献

1) H. Nakata, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 50(4), 173-188 (2002).

2) H. Nakata, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 63(1), 31-43 (2015).

 

 

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偶数電子イオンのフラグメンテーション-2:電荷移動の考え方

前回の記事に引き続き、LC/MS/MSによるプロダクトイオン分析で見られるフラグメンテーションについて解説します。今回は、偶数電子イオンのフラグメンテーション-2というタイトルにしていますが、恐らくは偶数電子イオンに特化したものではなく、LC/MS/MSで用いられる開裂法である低エネルギーCIDにおけるフラグメンテーションの考え方になります。

 

フラグメンテーションの基本的な考え方は、図1に示すポテンシャルエネルギー曲線によって説明できます。

ポテンシャルエネルギー曲線

図1 フラグメンテーションにおけるポテンシャルエネルギー曲線

 

あるイオンにCID等によってエネルギーが与えられる時、そのイオンの内部エネルギーが、イオンの中の結合が開裂する反応(フラグメンテーション)の活性化エネルギーを超えるとそのフラグメンテーションが起こります。低エネルギーCIDは、例えば四重極コリジョンセルを用いる場合、プリカーサーイオンは数eV~最大200 eV程度の運動エネルギーでHeXeを充満したコリジョンセルに導入され、低いエネルギーで何度も衝突繰り返す事で徐々に内部エネルギーが上昇する。そして、最も低い活性化エネルギーを超えたところでそのフラグメンテーションが起こります。一つのイオンから複数のフラグメンテーションが起こり得るとき、低エネルギーでは最も低い活性化エネルギーのフラグメンテーションのみが起こり、それ以外のフラグメンテーションは基本的には起こり得ません。しかし、低分子化合物にしろペプチドにしろ、フラグメントイオンが1つしか生成しないという例は殆どありません。

 

前回も用いたアルギニンのプロトンが付加のプロダクトイオンスペクトルを図2に示します。

Arg prodact ion spctrum

図2 アルギニンのプロトン付加分子のプロダクトイオンスペクトル

 

逐次反応によって複数のフラグメントイオンが観測される事は有り得ますが、それだけではこれだけ多くのフラグメントイオンが生成する事は説明できません。前回の記事に書いたように、プロトン付加分子のフラグメンテーションは、プロトンが付加した原子(正電荷)に対して近隣の結合の電子が動くことによって起こります。イオン化の際にプロトンが付加する原子は、プロトン親和力が支配的なので、アルギニンの場合は2つの1級アミノ基の窒素に限定される筈です。図2で観測されているm/z 157イオンは、プリカーサーイオンとのm/z 差が約18であり、H2Oの脱離によって生成すると考えられます。H2O脱離は、図3に示すように、カルボキシ基の水酸基上にあるプロトンに対して隣の結合の電子が二つとも動く事によって起こると考えられます。

 

Arginine Fragmentation MH-H2O

図3 アルギニンのプロトン付加分子からの脱水反応の推定機構

 

では、イオン化の際にカルボキシ基の水酸基酸素にプロトンが付加するのか?

 

それは恐らくNoです。上述したように、イオン化の際にプロトンが付加するのは、2つの1級アミノ基の窒素に限定される筈です。そして、CIDによって励起状態になったとき、プロトンが水酸基に移動し、図3に示すフラグメントイオンが起こったと推測されます。このようなフラグメンテーションに先立ってプロトンが分子内を移動する現象は、ペプチドでは°mobile proton°として報告例があります1)。低分子化合物においても、ペプチドと同様なmobile proton現象は起こり得ると考えて良いでしょう。

 

文献

1) R. Boyd and A. Somogyi,  J. Am. Soc. Mass Spectrom., 21, 1275-1278 (2010).

 

 

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LC/MSで観測される偶数電子イオンのフラグメンテーション-1

質量分析計特にGCやLCとのハイフネーション装置であるGC-MSやLC-MSは、現在定量分析に多く用いられています。しかし、質量分析は元々は定性分析のための機器分析法であり、そのためにはマススペクトル特にフラグメントイオンの解析は重要です。

 

電子イオン化(electron ionization)については以前のブログに書きましたが、GC/MSに用いられているイオン化法であり、そのマススペクトルで観測されるフラグメントイオンの解析については、「有機マススペクトロメトリー入門」を始め幾つかの良書があります。また、EIで得られたマススペクトルは、NISTやWilleyなどの豊富なマススペクトルライブラリーによって、その解析の難易度は比較的低く感じられます。実際には、そんな事はないのですが...

EIでは、気化した試料分子に熱電子を照射し、分子から電子が1つ脱離した分子イオンや、それが断片化したフラグメントイオンが観測されます。分子は中性状態で必ず偶数個の電子をもつため、分子イオンは奇数個の電子をもつ奇数電子イオンです。

 

一方、LC/MSに用いられているエレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization, ESI)や大気圧化学イオン化(atmospheric puressure chemical ionization, APCI)で生成するイオンは、分子にプロトンやナトリウムイオンが付加した、あるいは電子からプロトンが脱離したイオンなどが主であり、これらは中性分子と同じ電子状態即ち偶数電子イオンです。偶数電子イオンは中性分子と同じ電子状態であるため安定で、定性分析のためにはMS/MS(プロダクトイオン分析)が用いられます。LC/MS/MSにおけるプロダクトイオン分析には、低エネルギー状態での衝突誘起解離(collision induced dissociation, CID)が殆どの場合に用いられます。奇数電子イオンと偶数電子イオンとは、電子状態が異なるため、開裂の仕方(フラグメンテーション)も異なる場合があります。

 

今回から何回かに分けて、偶数電子イオンのフラグメンテーションについて、低エネルギーCIDを中心に解説します。フラグメンテーションは、分子(イオン)内の結合の開裂によって起こります。共有結合(単結合)は電子2個によって成り立ち、結合の開裂とは即ち電子の動きです。+の電荷をもつ正イオンの場合、フラグメンテーションは、-の電荷をもつ電子が正電荷に向かって動く事により起こります。

 

よく観測される例を見てみましょう。図1は、アミノ酸の一種であるアルギニンのプロトン付加分子([M+H]+, m/z 175)をプリカーサーイオンとしたプロダクトイオンスペクトルです。測定に用いた装置は、Q-Exactiveです。

 

Arg prodact ion spctrum

図1 アルギニンのプロトン付加分子のプロダクトイオンスペクトル

 

1中のm/z 158.0916イオンは、プリカーサーイオンとのm/z差が約17なので、アンモニア(NH3)の脱離に相当します。このフラグメンテーションは、図2のように説明する事ができます。プロトンが付加する位置は、非共有電子対をもつ原子が最も可能性が高く、プロトン親和力が支配的です。アルギニンには複数の窒素と酸素がありますが、2つの1級アミノ基の窒素が最も高いプロトン親和力をもつと考えて良いでしょう。アミノ基にプロトンが付加し、その正電荷に向かって隣の結合の電子が2つとも動く事により、アミノ基は中性のアンモニアとして脱離し、根元の炭素は電子が1つ足りない状態になるため正電荷をもちイオンになります。1級アミノ基は2つあるため、アンモニアが脱離してm/z 158イオンが生成するプロセスは、図2に示す両方の可能性があります。この種のフラグメンテーションは、水酸基にプロトンが付加してH2Oが脱離するプロセスも同様で、頻繁に観測されます。

 

Arg mz175-158

2 アルギニンのプロトン付加分子からm/z 158イオンが生成する推定プロセス

 

 

 

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ESIにおけるイオン化抑制とPESI

以前書いたエレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization, ESI)におけるイオン化抑制に関する記事について、「エネルギー供給を絶たれた帯電液滴」からのイオン生成プロセスが、イオン化抑制の原因になると言う解説をしました。今回はその続編、以前の解説を補足する記事を書いてみます。

 

山梨大学の平岡先生が開発された「探針エレクトロスプレー」という技術があります。そのイオン生成機構が、そのまま前回解説の補足になります。探針エレクトロスプレーは、英語ではprobe electrospray ionizationとなり、PESIと略されます。PESIについては、平岡先生の総説1)をご参照ください。ESIは、コンベンショナルからナノまで、サイズによって量は大きく変わりますが、キャピラリー先端部分では試料溶液は連続流体として供給されています。一方PESIは、探針の先端に試料溶液を付着させ高電圧を印加する事で、探針の先端に形成されたテイラーコーンから直接イオンが生成するイメージです。コンベンショナルESI、ナノESIPESIの比較と、PESIに用いた探針先端のSEM画像を図1に示します。また、PESIの構造と動作の様子を図2に示します。

探針に付着する試料量は数pLと極微量であるため、試料に対して電圧(エネルギー)が供給される確率はコンベンショナルESIやナノESIに比べて極めて高く、テイラーコーンから生成する帯電液滴のサイズは極小さく電荷密度は非常に高くなります。そのため前述したように、帯電液滴を経ずに直接生成するイオンも存在すると考えられます。

 

PESI-1

1 コンベンショナルESI、ナノESIPESIの比較と、PESIに用いた針先端のSEM画像1)

 

PESI-2

2 PESIの構造と動作1)

 

PESIでは、通常のESIの様に試料溶液が供給し続けられる事がないため、高電圧を印加し続ける事により、試料溶液は帯電液滴となってあるいは直接イオンとして、探針表面から放出され徐々にその量は減少していきます。通常のESIでは分析種のイオン化抑制の原因となる物質が試料溶液に含まれているとしても、探針に電圧を印加し続ける事により、イオン化し易い物質が先にイオン化し、その後残りの物質がイオン化される、という現象が起こります。それが顕著に示されている例を図3に示します2)。これは、界面活性剤であるトリトンX100とタンパク質であるシトクロムCの混合溶液を、ナノESIPESIで測定した時のマススペクトルです。濃度は、トリトンXの方が100倍高い条件です。界面活性剤はイオン化抑制の原因物質の一つなので、この試料はトリトンXの混在によってシトクロムCのイオン化が抑制されて検出されない事を想定したものだと思います。そして、その想定通り、ナノESIではトリトンXのイオンのみが検出され、シトクロムCイオンは検出されていません。一方PESIのデータでは、最初はトリトンXのイオンのみが検出されていますが、その後も探針に電圧を印加し続けるとシトクロムCのイオンが検出されるようになり、最終的にはシトクロムCのみのイオンが検出されています。この現象は、PESIでは探針に電圧を印加し続ける事によってシーケンシャルなイオン化が起きている事を示しています。また、以前の記事に書いた通り、ESIにおけるイオン化抑制の原因が、エネルギー供給を絶たれた帯電液滴からのイオン生成プロセスにある事も併せて示しています。探針に試料を付着させて電圧を印加した状態を、ESIで生成する帯電液滴に見立てます。図3に示したPESIのデータにおいて、上段のトリトンXのみが検出されている状態は、ESIにおいて生成したエネルギー供給が絶たれた帯電液滴からイオンが生成している様子と同じです。PESIにおいても、この状態で電圧印加をやめてしまえば、その後シトクロムCが検出される事はありません。トリトンXのイオン化によって、帯電液滴内の過剰電荷が失われてしまうからです。

ESIにおいても、テイラーコーンから放たれた帯電液滴に対して、追加でエネルギー供給をする事が出来れば、原理的にはイオン化抑制は低減されると考えられます。Watersが開発したUniSpray TMにはその効果があると期待していたのですが、今のところそのような効果は見られないとのことです。

 

PESI vs NanoESI

3 ナノESIPESIの測定データ比較2)

 

文献

1) 平岡賢三、分析化学、59, pp. 95-105 (2010).

2) 平岡賢三、2013年度第二回TMS研究会講演会要旨集 2013_2_05_Hiraoka.pdf (tms-soc.jp)

 

 

 

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軟X線重畳ESIイオン源の論文

 

もう4年前になりますが、古巣の人達と一緒に実験した結果を質量分析総合討論会に発表しました。

論文書かなければと思いつつ、なかなか手を付けられませんでしたが、最近になってようやく書き始めました。

もう少しかかりますが、書きあげて投稿までもって行きます。

こうやって宣言すれば、途中で止められなくなりますからね!

 

で、内容はESIに軟X線を重畳照射すると、ある種の化合物でイオン強度が増加すると言う内容。

その理由をどう考察するか、色々と考えているところです。因みに、大分前に特許も出願済みです。

データを1つだけ紹介します。試薬はアントラキノンです。

 

ESI-X benzanthraquinone

 

上段がESIで測定したマススペクトル。構造的にはESIに向かない化合物なので、シグナル強度は低く、やっとイオンげ検出されたレベル。中段が軟X線重畳ESIのデータ。プロトン付加分子の強度は約40倍に増加しています。下段は軟X線のみ、ESIと同程度のイオン強度です。

 

実用化についても、何とかしたいと思っています。ご興味あれば、ご質問などお待ちしています。

 

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TOF-MSでスキャンは原理上正しくない

先日、ある質量分析計関連メーカーさんが作成した依頼分析のレポートを見る機会がありました。装置はQTOF-MSです。

そして、測定条件の部分に、以下の記載がありました。

・測定法     MS Scan

・スキャン範囲  m/z 20 – 1200

・スキャン時間  1 sec

 

この記載内容には、間違いが2種類あります。

1つは、m/zのmとzがイタリックになっていないこと。まぁ、これは忘れてだけかも知れませんので、軽微な間違いと言えるでしょう。

 

もう1つは、これは何度かブログに書いていますが、装置がTOFなのにスキャンと言う用語を使っている事です。

TOF-MSでは、マススペクトルを取得する際、原理上電圧走査(スキャン)を行いません。つまり、スキャンと言う用語は、TOF-MSに対しては原理上用いる事ができません。これは、QTOF-MSでも同じです。QTOF-MSでも、マススペクトルを測定するのはTOFですから。

 

上の3つの条件を正しい用語で書くなら、以下のようになるでしょうか。

・測定法          マススペクトル取得モード

・測定m/z範囲       20 – 1200

・マススペクトル取得時間  1秒

 

メーカーさんの人は専門家と言える筈なので、原理上正しくない用語は使って欲しくないですね。

 

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