質量分析原理など

質量分析のソフトイオン化温故知新:Frit-FABのあれこれ-1

5/1719に行われた第65回質量分析総合討論会の“メタボロミクス温故知新”でイオン化の話をしてきた内容の一部を3回紹介してきました。

1回目:第65回質量分析総合討論会に参加して:イオン化温故知新、ESIFABの比較-1

2回目:第65回質量分析総合討論会に参加して:イオン化温故知新、ESIFABの比較-2

3回目:質量分析のソフトイオン化温故知新:ESIFABの比較-3

 

今回はその続き、4回目です。前回に引き続き、今回の記事に挿入している図や写真は、日本電子の松浦健二氏と旭川医科大学の阿久津弘明氏にご提供頂きました。冒頭でお礼申し上げます。

 

前回の投稿では、FABfast atom bombardment、高速原子衝撃法)イオン化とそれを使ったLC-MSインターフェースであるFrit-FABについて解説しました。今回は、日本電子在職中にFrit-FABを使っていた当時(1990年~1995年頃)を思い出しつつ、あれこれ書いてみます。

 

FABは真空中でのイオン化であり、Frit-FABでは、キャピラリーを介して液体を真空中に導入します。液体は気体に変わる時に約1000倍体積が膨張するため、質量分析計の真空度を維持するためには、Frit-FABへの液体導入量は約5 µL/minに制限されます。日本電子でFrit-FABをメインで扱っていた当時、HPLCの標準的な移動相流量は1 mL/minでした。今でこそプロテオミクスなどの研究分野でミクロHPLCやナノHPLC1)が普及していますが、当時はまだ、小スケールのHPLCは殆ど普及していませんでした。

Frit-FAB LCMSシステム

 

1 mL/minの移動相に対して、ポストカラム(HPLC出口)でマトリックス溶液を0.3 mL/minで添加し、それを約5 µL/minにスプリットして使用していましたので、スプリット比は実に1/260! カラムに注入した試料の1/260しかイオン源に入らなかった訳です。私の当時の職場はMS応用研究グループ、主な仕事はお客様への装置のデモンストレーションや依頼分析でした。これらは所謂販促支援活動であり、装置を売るために競合他社とデータ競争をすることになります。

 

日本国内でESIelectrospray ionization、エレクトロスプレーイオン化)が使われ始めた当初は、今のようなネブライザーガスを使う技術は無く、静電的な作用のみで帯電液滴を生成させる純粋なエレクトロスプレーでした。静電的な作用のみで帯電液滴を生成させることでできる液体導入量は約5 µL/minが上限であり、Frit-FABとほぼ同じでした。また、その頃のESIはイオン化の状態も不安定で、HPLCとの直結はなかなか困難でした。当時早々にESIを導入していたメーカー各社では、HPLCとの接続を試みてはいましたが、それ程良いデータは得られておらず、Frit-FABでも十分対抗できていました。

 

その後、ESI1 mL/min条件のHPLCを直結させるために様々な技術改良がなされ、加熱ネブライザーや超音波ネブライザーなどの技術を経て、現在の高圧窒素ガスを用いた空圧ネブライザーに落ち着きました。ソニックスプレー2)もこの頃に開発された技術です。

 

空圧ネブライザーの技術開発に差動排気領域での高周波イオンガイドの技術開発が加わり、ESIは今のような構成になったと記憶しています。コンベンショナルHPLC(移動相流量 1 mL/min)との接続が可能になったとはいえ、ESIのイオン化メカニズム的には移動相流量は少ない方が良いことは分かっていました。コンベンショナルHPLCでセミミクロ流量でのグラジエント溶離が可能になり、セミミクロHPLC+空圧ネブライザー方式のESIという組み合わせが一般的になったのは、私がまだMS応研に居た1995年頃ではなかったでしょうか?

 

この頃のESIの進歩は速かったですね! 日本電子はまだFrit-FABが主力でしたから、内径2 mmのカラムで移動相流量200 µL/minのセミミクロHPLCと組み合わせてもスプリット比は1/40以上、感度面でESIに到底及ばず競合他社とのデータ競争では苦戦を強いられました。

 

そこで私は、ミクロHPLCに走りました。当時、野村化学に居た長江さんが、内径0.3 mmのミクロカラムを盛んに開発していて、コンベンショナルHPLCをミクロHPLCに改造する方法を紹介されていました。プレカラムスプリットによる方法です。内径0.3 mmのカラムの最適な移動相流量は約5 µL/minですから、Frit-FABへの接続には最適です。試料注入量は少なくなりますが、カラムに注入した試料は全てイオン源に導入されるので、高感度分析が可能でした。これで随分とアプリケーションデータを取得したものです。長江さんには、ミクロHPLC構築の際には大変お世話になりました。

 

ミクロHPLCFrit-FABを組み合わせて測定した様々なデータを、ユーザーズミーティングでよく紹介したものです。しかし、当時はまだHPLCのスケールダウンはセミミクロまでで、今のようにミクロやナノスケールのHPLCが一般的になると思っていた人は、かなり少なかったのではないでしょうか? ミクロLCと言えば、私達やもう少し先輩の方達には石井大道先生3)がお馴染みで、その頃より前からミクロスケールLCの研究をなさっていましたが、実際、ユーザーズミーティングでミクロの話しをした時など、聴講者の中からは“ミクロLCなんて今後の発展が期待できない技術を何故使うのか”などの質問が出たのを覚えています。私は、GCの変遷を見ればLCでもミクロ化が主流になると思っていたので、そのように答えましたし、その後日本電子がAnalytica of BranfordESIを採用し、ついで自社のESIを開発した後でも、ミクロやナノLCの技術は継続して身につけるようにしていました。

 

その時の、コンベンショナルLCからミクロLCを構築する技術は、今の仕事でも役に立っていて、LC/MSの技術指導を請け負っているJXエネルギー㈱様との共同研究で用いました。

 

FABは、マトリックス由来のイオンが顕著に観測されることがデメリットであることを除けば、FABは非常にシンプルで解析し易いマススペクトルが得られる有益なイオン化法です。化合物の性質に応じて複数のマトリックスから適するものを選択する必要があることは、MALDIに近いものがあります。しかし、Frit-FABを用いることで、マトリックス由来のイオンを減算したマススペクトルが得られますし、以前解説したようにFrit-FABはダイナミックな状態の溶離液+マトリックスにキセノンを照射するため、通常のスタティックFABほどマトリックスと分析種との相性が重要ではなくなります(標準的なグリセリンでより多くの化合物をイオン化できる)。

レセルピン_マススペクトル_FAB

レセルピンのマススペクトル(FAB)

 

レセルピン_マススペクトル_Frit-FAB

マトリックスイオンを減算したレセルピンのマススペクトル(Frit-FAB)

 

ミクロLCやナノLCがかなり普及してきた現在、様々なメリットをもつFrit-FABがもう一度見直されても良いのではないかと強く思っています。Frit-FABが今一つ普及し切れなかったこととして、fritと呼ばれる焼結フィルターの問題がありますが、これも現在の加工技術を使えばクリアできると思います。これについては、また改めて書いてみたいと思います。

 

引用文献

1) Y. Ishihama, Chromatography, 29(1), 25-31 (2008).

2) A. Hirabayashi, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 47(5), 289-296 (1999).

3) 石井大道、分析化学、49(12), 929-940 (2000).

 

 

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新規LC-MSイオン源の開発:その後の進捗状況20171019

少し前から開発中の新しいLC-MSイオン源について、今年の質量分析総合討論会で発表しようとして、データの再現性が得られず断念したことがありました。

その時の記事はこちら。

 

その後も実験を継続していて、つい最近“これは!”と思うデータが取得できました。その一部を紹介します。今度こそ、来年の質量分析総合討論会で発表する予定です。このイオン源、幾つかのLC-MSメーカーでもやっているコンビネーションイオン源です。ESIに対して+αのエネルギーを印加することで、ESIではイオン化され難い化合物をイオン化できるという狙いで開発しています(特許出願済み)。

 

添付のマススペクトル、試料は1, 2-ベンズアントラキノン(C18H10O2, ノミナル質量258)。最上段はESIのみ、m/z 259イオン([M+H]+)は僅かに観測されていますが、強度は非常に低いです(m/z 259イオン強度315)。m/z 281イオン([M+Na]+)も観測されています。

中段はESI+α、m/z 259イオンがメインピークとなり、その強度は13,048であり、ESIのみの約40倍です。

下段はESI無のαのみ、m/z 259イオン強度は僅かに225

ESI+αイオン源データ

 

他にも同様な化合物を幾つか試してみましたが、同じ傾向を示し再現性は得られています。αのみでは殆ど分析種由来のイオンは観測されていないことから、ESIとの組み合わせにおいてのみ効果を発揮することが示唆されます。

 

+αの部分についてはまだ改良の余地があるので、その作業を行いながら、他の化合物も試していくつもりです。

 

“うちの化合物を試して欲しい”などご要望ありましたら、お気軽にご連絡下さい。共同研究のご提案も大歓迎です。

 

 

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LC/MSに適する・適さない溶離液、揮発性でもイオン化抑制を起こす溶離液はある

LC/MSに使用する溶離液には、基本的に“揮発性であること”が求められます。これは、不揮発性(の塩を含む)溶離液が以下の点でLC/MS分析に不具合を生じさせるためです。

 1. 不揮発性塩のイオン化効率が高く(ESIで顕著)、分析種のイオン化を抑制してしまう

2. 不揮発性塩がイオン源に析出して、ニードルやオリフィス(コーン)などを目詰まりさせる

3. 不揮発性塩がイオン源に残存して、その後の分析に悪影響を及ぼす

 

しかし、従来LC分析においては、リン酸塩緩衝液を代表とする不揮発性(の塩を含む)溶離液が多用されてきました。リン酸塩緩衝液がLC分析で多用されている理由は、①低波長領域に吸収をもたないこと、②幅広いpH領域で緩衝能を示すために分離条件の検討が容易であること、などが挙げられます。

 

例えばリン酸塩緩衝液を用いたLC条件が確立されている試料があり、それをLC/MSに移行する場合、通常は酢酸アンモニウムやギ酸アンモニウムなどの揮発性溶離液に変更する必要があります。しかし、その際に試料中成分の分離挙動が変わってしまい、目的成分(分析種)の相関が分からなくなることがあります。この問題に対して、例えばアジレント・テクノロジー株式会社のアプリケーションノートでは、二次元LCを用いた方法を紹介しています。この方法は確かに有用ですが、専用システムが必要なので、なかなか手が出せないというLC/MSユーザーもいると思います。

 

ソルナック(カートリッジ&チューブ)は、そのような場合に使える技術として開発しました。もちろん万能な技術ではありませんが、LCMSの間にソルナックを接続するだけで、簡便にリン酸塩緩衝液を用いたLC/MSが実現可能です。

 

さて、LC/MSに使える揮発性溶離液の中にも、分析種のイオン化を抑制してしまうものがあります。その代表例は、TFA (trifluoroacetic acid、トリフルオロ酢酸)HFBA heptafluorobutyric acid、ヘプタフルオロ酪酸)などのパーフルオロカルボン酸です。これらは、塩基性化合物に対するイオン対試薬としてLC/MSに用いられますが、酸性度が高すぎるためにニードルと対向電極との間に流れる電流量が大きくなり過ぎて、分析種のイオン強度が減少してしまうという問題が起こります。そこで、ソルナックを溶離液中のTFA除去のために用いてみました。

ソルナックチューブ_TFA除去

 

試料はタンパク質。タンパク質の分析と言えばプロテオーム解析を思い浮かべる人が多いと思います。プロテオーム解析では、タンパク質を酵素消化してLC(逆相分配クロマトグラフィー)-MS/MSMALDI-TOFMSで分析してタンパク質の同定などを行います。タンパク質を酵素消化して得られたペプチド混合物のLC-MS/MSでは、LCの溶離液にはギ酸が主に用いられます。しかし、酵素消化しないインタクトタンパク質を逆相分配クロマトグラフィーで分離する場合、ギ酸よりTFAの方が適しています。

 

TFA溶離液を用いたインタクトタンパク質のLC/MS分析において、ソルナックチューブを用いてTFAを除去することで、ソルナックチューブを用いずTFAをイオン源に導入した場合と比較して34倍高いシグナル強度が得られました。ギ酸を溶離液に用いた時との比較データも掲載しています。詳細はアプリケーションノートをご覧ください。⇒ TFA溶離液を用いたインタクトタンパク質のLC/MS分析(TFA除去によるイオン化抑制の低減)

 

 

 

 

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LC/MS用オンライン脱塩チューブ”ソルナックチューブ”の大量注文が来ました

先月に行われたJASIS2017でカタログをお渡ししたお客様より、ソルナックチューブ50本の大量注文を頂きました(^_^)

以前からご興味をもって頂いていたようで、初回購入分50%OFFの機会を利用して頂きました。

 

ソルナックチューブの新規発売記念、初回購入分限定50%OFFキャンペーンは今月末までです。

ソルナックチューブは、LC溶離液に含まれるリン酸塩を、LCカラムの出口で一定時間(一定量)トラップできる世界初のエムエス・ソリューションズ独自技術です。

リン酸塩の他、TFAやアルカリ金属イオンをトラップできるタイプもあります。ご興味あれば、この機会にお試し下さい。

SALNAC Tube

 

 

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今では余り使われていないMS/MS法:リンクドスキャンとMIKES

群馬高専で初めて質量分析をした時の研究内容(測定技術の話)を、以前の記事で書きました。

 

今回は、群馬大学に編入して、B4~M2での研究で使っていた質量分析技術について書いてみます。

 

高専でも群大でも、磁場でイオンを曲げてm/z を分ける(加えて電場でエネルギーを揃える)二重収束質量分析計を使って研究していました。違うのは、高専で使っていた装置は磁場が前で電場が後ろ、群大で使っていた装置は電場が前で磁場が後ろ、配置が逆さまになっています。

 

電場が前の場合を正配置、磁場が前の場合を逆配置と言います。

セクターMS

 

配置が違うからどうだって言うと…

 

両方共以前解説したメタステーブル分解を観測できるのですが、逆配置ではある特定のm/z 値のイオンだけが通過するように磁場を固定し、そのイオンが磁場を通過して電場に入る前に開裂して生成した断片化イオンを電場で分離します。電場に入る前に開裂・断片化したイオンは、元のイオンより運動エネルギーが小さくなっているので、電場強度を下げることで通過できます。そして、通過した時の電場強度からそのイオンのm/z 値が分かります。

 

正配置の二重収束質量分析計では、イオン源を出た直後に開裂して断片化したイオンのマススペクトルを測定します。電場と磁場を連動(リンク)させて、その強度を走査(スキャン)することで、運動エネルギーの小さくなった断片化イオンを電場・磁場両方で収束させることができます。

 

これら2つの測定法、前者をMIKES (mass analyzed ion kinetic energy spectrometry)、後者をリンクドスキャンと言います。

 

群大ではこのリンクドスキャンを駆使して、有機ケイ素化合物の分解機構を解析し、同じ化合物の光分解反応と比較する研究を行っていました。

 

同じ化合物でも、片や気相分子から電子が1つ脱離したイオンに不活性ガスを衝突・励起させた時の分解、片や溶液状態の分子に光(紫外線)を照射・励起させた時の分解、分解機構は当然異なりますが共通性もありました。

 

リンクドスキャンもMIKESも一種のMS/MSであり、特定のm/z 値のイオンから生じるプロダクトイオンを観測できるのですが、違いは、MIKESがプロダクトイオンを電場のみのスキャンで分離するのに対して、リンクドスキャンは電場と磁場の両方で分離することです。

 

リンクドスキャンは、プロダクトイオンを二重収束で分離するため高分解能マススペクトルが得られると言うメリットがあります。高分解能と言っても、m/z 数百の領域で同位体の質量差(1 Da)が分離できる程度でしたが。

 

一方MIKESは、電場のみのスキャンなので、プロダクトイオンスペクトルの分解能は低く、ピークはブロードニングします。MIKESの利点は、ピーク幅から運動エネルギー放出(kinetic energy release, KER)値を計算できることです。イオンは一定の運動エネルギーをもって飛行し、飛行中に開裂する時運動エネルギーの一部を放出し、それがピーク幅となって現れます。

 

では、KER値が分かると何が良いか?

KER値から、そのフラグメンテーションが単純開裂か転位反応を伴う開裂かを区別できるのです。

 

今の仕事を始めてから、天然物の高分解能LC/MS/MS分析を行うことが多く、低エネルギーCIDによって得られたプロダクトイオンスペクトルを解析します。学生の時はフラグメンテーション解析が研究テーマでしたが、前職ではLC/MS/MSはできる環境にありませんでした(装置を開発していなかった)。

 

そして今の仕事をする中で、LC/MS/MSのデータ解析において、あるフラグメントイオンが単純開裂によって生成したのか転位反応を伴う開裂によって生成したのかが判別できれば、未知化合物のマススペクトルを解析する上でかなり楽になるのは間違いないですね❗

 

今の汎用装置では、単純開裂と転位反応を伴う開裂を区別できる測定法は不可能です。一方、当時のMIKESを今のLC/MS/MSにそのまま応用できるかと言うと、それもまた不可能です。温故知新、昔の技術と今の技術の融合、やってみたいことは沢山あるな~...

 

 

 

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質量分析のソフトイオン化温故知新:ESIとFABの比較-3

5/1719に行われた第65回質量分析総合討論会の“メタボロミクス温故知新”でイオン化の話をしてきた内容の一部を2回紹介してきました。初回はこちら2回目はこちら

今回はその続き、3回目です。今回の記事に挿入している図や写真は、日本電子の松浦健二氏と旭川医科大学の阿久津弘明氏にご提供頂きました。冒頭でお礼申し上げます。

 

今までの2回で、ネブライザーガスを用いる通常のESIでイオン化抑制が起こり易いのは、エネルギー供給を絶たれた状態の帯電液滴から時間をかけて単分子イオンが生成するプロセスに原因があるという解説をしてきました。

 

今回は、FABfast atom bombardment、高速原子衝撃法)でも似たような現象が起こることを解説します。これを理解すると、ESIにおけるイオン化抑制をより良く理解できると思います。図1に、FABイオン源の概略図とFABターゲットの写真を示します。

 

FABイオン源

図1

 

FABは、金属製のターゲットに試料溶液とマトリックスの混合液を塗布して真空中に導入、高速のキセノン原子を衝突させることでスパッタリング現象によってイオンが生成します。マトリックスにはグリセリンやm-ニトロベンジルアルコールなどが用いられ、イオン化促進剤として主に分析種分子とのプロトン授受の役割を果たします。

 

FABイオン化を用いたLC-MSインターフェースはFrit-FABと呼ばれ、私の前職である日本電子のオリジナル技術です。今では殆ど使われていませんが、1990年に日本電子に入社して暫くの間は、専らFrit-FABでアプリケーションデータ取得などの仕事をしていたものです。図2Frit-FAB LC/MSシステムズを、図3Frit-FABプローブの概略図を示します。Frit-FABでは、LCの溶離液に対してマトリックス溶液をポストカラム添加し、スプリットしてその一部(約5 µL/min)を、キャピラリーを介してFrit-FABプローブに導入します。Frit-FABプローブの先端にはFritと呼ばれるステンレス製の焼結フィルターが備えられており、キャピラリー先端はFritの表面に接しています。約5 µL/minに制御された溶離液+マトリックス溶液は、キャピラリー先端からFritに浸透して表面に滲み出し、中央から外側に向かって広がります。

 

Frit-FAB LCMSシステム  Frit-FAB概略図

図2                      図3

 

Frit-FABでは、Frit表面に常時新しい液体(試料+マトリックス溶液)が供給される(湧き出してくる感じ)ので、動いているという意味でダイナミックFABとも呼ばれます。一方通常のFABは、試料とマトリックスはターゲットに塗布した状態で動きがないのでスタティックFABとも呼ばれます。

 

FABは、ターゲットに塗布された試料+マトリックスに対して連続的に高速キセノン原子が衝突し、表面から直接単分子イオンが生成するため、ネブライザーガスを用いる通常のESIで起こるようなイオン化抑制は起こり難いと言えます。しかし、試料とマトリックスの物性の関係によって、スタティックFABではイオン化抑制が起こり、同じ試料とマトリックスの組み合わせでもダイナミックFABではイオン化抑制が起こらないという状況があります。その状況を、図3を用いて解説します。

 

試料とマトリックスの混合溶液は、図4に示すように厚みをもっていて、イオンはその表面から優先的に生成すると考えられます。混合溶液が均一な状態であれば、図4(a)のように溶液表面からはマトリックスイオンと試料イオンの両方が生成します。しかし、試料とマトリックスの物性の関係において、試料分子がマトリックスの内部に取り囲まれるようになり表面に出て来られなくなる状況が起こるとすると、図4(b)のようにマトリックスが優先的にイオン化して、試料分子はイオン化抑制を受けることになります。この状況は、ESIで界面活性作用をもつ物質が液滴表面に集まることで試料成分のイオン化を抑制する状況と良く似ています。

 

FABイオン化抑制

図4

 

FABというイオン化法、ESI程スペクトルが複雑にならないし、基本的にはソフトイオン化の部類ですが適度なフラグメントイオンが生成するし、幅広い性質の化合物をイオン化できるし、とても有用なイオン化法なのですが、最近あまり使われなくなってきているのは寂しい限りです。特に、Frit-FABでは、スタティックFABよりマトリックスの選択が重要ではないので、特に有用です。しかし、最近よく使われている四重極やTOFOrbitrapといった質量分離部に対して、FABを採用するメーカーが少ない(というか無い)のですよねぇ...

 

磁場型にずっとFABを付けてきた日本電子でさえ、TOFにはFABを付けませんからねぇ...

 

昔から質量分析をやってきた人達は、やっぱりFABに馴染みがあるので、今の装置にFABがついてくれると嬉しいと思っている人は結構いると思うのですが...

 

FABイオン化を試してみたいという方は、日本電子で受託分析を受け付けているようです。

 

私は、個人的にFrit-FABに対して思い入れがあるので、次回はFrit-FABについてもう少し詳しく書いてみます。

 

 

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